• 专利附录
  • 专利说明
  • 权利要求
  • 类似技术
  • 同族专利
  • 引用文献
  • 法律状态
  • 优先权
    • 专利摘要:

    公开号:WO1982001564A1
    申请号:PCT/JP1981/000303
    申请日:1981-10-28
    公开日:1982-05-13
    发明作者:Kagaku Kk Kanto
    申请人:Kawaji Haruhiko；Ono Toshihiro；
    IPC主号:C12Q1-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書
    [0002] 発 明 の 名 称
    [0003] Γ - グル タ ミ ル ト ラ ン ス ぺ フ。チダーゼ の活性測定用試薬
    [0004] 技 術 分 野
    [0005] 本発明は Γ 一 グ ル タ ミ ル ト ラ ンスぺプチ ダー ゼ の活性 測定用試菜に関する。 さ ら に詳 し く 言えば、 本発明は、 r - グル タ ミ ル - 4 - ニ ト ロ ァ ニ リ ド、 と シ ク ロ デ キ ス ト リ ン と を含有する こ と を特徵 とする r - グ ル タ ミ ル ト ラ ンスぺプチダーゼの活性測定用試薬に関する。
    [0006] r - グル タ ミ ル ト ラ ン ス べ プ チ ダ ー ゼ （ 以下 ？" - G P と略記する ） の活性測定には、 現在、 種 々 の基質が用い られて い る 力 、 中で も 、 L - r - グル タ ミ ル - 4 - ニ ト ロ ア - リ ド （ 以下 &1U - 4 - NA と略記する ) を用いる方 法は、 Szasz に よ る改良法 〔 Clin. Chem. 1 5 卷 1 2 4頁
    [0007] ( 1 9 0 9 ：) 〕が考案されて以来、 最 も盛んに行われてい る方法であ る。
    [0008] と こ ろで、 こ の Glu - 4 - NAを用いる方法は、 Glu -
    [0009] 4 - が、 水に対して非常に難溶性であ ]) 、 かつ、 不安 定で分解 し易い と い う 欠点を有 している。 そこ で、 こ の Glu - 4 の溶解性を増大せ しめるために、 従来、 一 般には、 塩該、 有接溶媒、 あ るいは界面活性剤な どを付 加的に用いる方法や、 熱を加え る方法な どが行われてい る。 と こ ろが、 溶薜性を增すための これらの種々 の方法 力；と られた と して も 、 こ れら の方法においては C-l - 4 - NAは、 Ύ - GTP 活性測定時において、 約 4 moleZ^ ( 4 mM ) までしか溶解せず、 しかも、 以下に述べる如き、 好 ま し く ない現象、 結果を招来する とい う問題が残されて いた。
    [0010] すなわ-ち、 これら の方法においては、 Glu - 4 - NAの 非酵素的分解が溶解時に起 ] 、 溶群後 も、 経時的に分解 反応が起るが、 こ の非酵素的分第に よ ] 、 グル タ ミ ン酸 と 4 - 二 ト ロ ア 二 リ ンカ ^生成 し、 こ の 4 - ニ ト ロ ア - リ ンが r - οτρの触媒作用を阻害する こ と と なる 〔 臨床化 学 7巻 2 5 5 頁 （ 1 979 ) 、 Clin.Cliem. 2 2卷 4 1 7 頁
    [0011] ( 1 9 7 0 ) 〕 。 また、 これら の物質の存在に よ ！？ 、 Γ - GTP活性測定にあたって考慮 しなければならない pH、 温 度、 基質濃度、 使用する緩衝物質の種類等々 のあ らゆる 条件に影響を与える こ と と な ] 測定時の至適条件の設定 が極めて複雑、 困難な もの とな る。 しかも、 r - GTP の 酵素活性は、 酵素的分解に よ ] 生成 した 4 - ニ ト ロ ア二 リ ン を分光光学的に測定する こ と に よ 1 行われる もので あ るから、 吸光度が大になればな るほど、 測定結果は著 し く不正確さ を増すこ と にな る。
    [0012] 本発明者らは、 Glut - 4 - NAを基質と して、 Γ - OTP の酵素活性の測定を行 う 方法につき、 種々研究を行った と こ ろ、 反応系にシク ロ デキ ス ト リ ン を添加する と、 Olu - 4 - NAの溶解性を著 し く 高める と と も に、 C-lu - 4 - NAの水又は緩衝溶液における非薛素的分解を抑制 し得る こ と を見出 した。 本発明はかかる知見に基づいてなされ た ものであ る
    [0013] ： r V.'L-O 発 明 の 開 示
    [0014] 本発明は r - ciTP の酵素活性測定用試薬と して、 r - グル タ ミ ル - 4 - - ト ロ ア - リ ド （ 基質 ） に シ ク ロ デキ ス ト リ ン を添加 して使用する こ と を特徵と し、 その目的 とする と ころは、 基質と して使用する r - ダル タ ミ ル -
    [0015] 4 一 - ト ロ ア - リ ド （ Glu ― 4 - NA ) の溶 性を高め、 しか も この基質の非酵素的分^を抑制する こ とに よ ]？、 従来技術に比 し、 著 し く正確に ダル タ ミ ル ト ラ ンス ぺブチダーゼの活性を測定 し得る試案を提供するにある。 基質と して使用する Glu - 4 - NAは、 従来法においては、 前述の如 く 、 水又は缓衝液に対 して、 精々 4 mMまでの溶 解性しか示さなかったのに対 し、 本発明の試案において は、 例えばシク デキ ス ト リ ン 0· 3 （ w v ) の添加で 10 m ( 4倍^上） という高い溶解度を得る こ と ができ る。
    [0016] また、 一方シク ロ デキ ス ト リ ン の添加は、 上述の Olu 一 4 - NAの溶解性の増大に加えて、 C-lu - 4 一 NAの安定 化効果を も、も たらす。 すなわち、 Glu - 4 - '-:Αの水溶液 又は緩衝溶液 （ 4 mLi ) を室温に放置する と、 その分解量 は、 2 4 時間で、 すでに約 2 7 AMに達し、 4 8 時間で約 5 5 AM、 7 2時間で、 約 8 0 M、 9 ό 時間で約 1 0 8 #Μ とい う 値を示すが、 こ の分解に よ ] 生成する 4 - ニ ト ロ ァニ リ ンは r - の触媒作用を阻害するため、 2 4時 間後において、 すでに、 本来 ？ " - C-T の有する酵素活性 が約 1 0 阻害されている こ と が判 ^ している。 これに 対 し、 シク ロ デキ ス ト リ ンを添加する と きは、 2 4 時間 後において、 G l u - 4 - NAの非酵素的分解は、 ほ とん ど 認められず、 1 2 0時間後において も、 その分解量は、 シ ク ロ デキ ス ト リ ン を添加 しない従 の も のの 2 4 時間後 の値とほとん ど同程度であ る と い う結果が認められる。
    [0017] こ の よ う に シ ク ロ デキス ト リ ン を添加する と 、 G l u - 4 - UA の溶解性を增大させ、 安定性を向上させ、 かつ、 T - GTP の触媒作用に全 く 影響を与え る こ と がないので、 本発明の試薬に よ ] 、 r - οτρ の活性を従来法に比 し、 著 し く 正確に測定する こ と が可能と なる ものであ る。
    [0018] そもそも、 酵素化学的研究においては、 酵素 -基質親 和性 （ Km ) の測定は重要な課題であ る と こ ろ、 r - C- P の Km測定は、 基質の溶^性が悪いため、 従来法において は低濃度領域において測定がな され、 高讒度領域に対 し ては推察的算定が行われていた も のであ るが、 本発明に よ ]5 、 高濃度領域の基質溶液が調製可能 と なった結果、 従来技術よ 著 し く 正確な測定値が得られる こ と と なつ 本発明において用いら れる シク ロ デキ ス ト リ ンについ ては、 通常、 試薬と しては、 - シク ロ デキ ス ト リ ン 、 ^ - シク ロ デキ ス ト リ ン 、 r - シ ク ロ デキス ト リ ン カ ^知 られ、 これらの混合^と して も提供されているが、 その いずれも使用する こ とが可能であ ] 、 純度その他特に特 定されるべき条件はない。 コ ス ト ならびに水溶性の点力 らは、 β - シク ロ デキ ス ト リ ン の使用が好ま しい態様と して推奨される。 本発明の試薬に関 して、 特肇されるべき利点は、 凍結 乾燥製品 と してそれを提供 し得る こ とであ る。 すなわち、 従来、 G1U - 4 - NA を主成分 とする r - GTP 酵素活性測 定用試案は、 前述 したとお ]3、 Gin - 4 - NAが難溶性で あるため、 種々 の可溶化手段を用いて、 よ う や く 4 m 程 度の濃度を得ている ほどであって、 試案と して、 凍結乾 燥した製品とする こ とは、 到底不可能であったが、 本発 明に よ る、 シク ロ デキ ス ト リ ン と の組合せ使用に よ ] 、 凍結乾燥製品を提供する こ とが可能となった。 すなわち、 (Jlu ― 4 - NA とシクロ デキ ス ト リ ン と の混合溶液を凍結 乾燥 したも のを用いれば簡便な操作で、 r - GTP の測定 を行 う こ とができ る ので、 本発明に よって 7" - GTP の測 定作業を著 し く簡便にする と い ぅ れた利点が もたら さ れる こ と とな る。
    [0019] ¾下に本発明の実施例を掲げる。
    [0020] 実施例 1 了 - GTP の蓐素活性測定
    [0021] A. 試薬の調製
    [0022] 緩衝液 ： グ リ シ ル グ リ シ ン 6. 2 と ジ エ タ ノ ール ァ ミ ン 1 0. 5 ^ とを約 9 0 0 « の蒸留水に溶力 し、 塩漦 を用いて pH & 2 ( 3 0 1C ) と した後蒸留水を加えて 1 0 0 0 ^ とする。
    [0023] 基質液 ： L — 7* - グ ノレ タ ミ ル - 4 - ニ ト ロ ァニ リ ド 4· ό と シク ロ デキス ト リ ン 2. 7 ^ と を上記 ）の 缓衝液 で溶 する。
    [0024] 測定溶液 ： 上記 H)の緩衝液 3 0 0 m£と上記 (口）の基質 v、 、 液 とを混合して、 溶液 とする。
    [0025] B . 測定操作
    [0026] 上記 の測定溶液 2. 5 τ ^を約 2 分間予傭加温し（ 3 0 で ） 、 これに測定対象の酵素溶液 0. を加え、 よ く 振 ] 混ぜた後分光光度計にて、 4 0 5 nm における 1 分 間の吸光度の増加を測定する。
    [0027] C. 単位 （ 活性 ) の計算
    [0028] 1 分間当 1 の吸光度の増加量を X とする と 単位（活性） 1 0 00 = Χ χ 2 ό 2 ό
    [0029] 9.9 X 0.1
    [0030] とな る。
    [0031] 実施例 2 Τ - GTP の Glu - 4 - NAに対する酵素基質親 和性 （ Km ) の測定
    [0032] A. 試薬の調製
    [0033] 実施例 1 に記載 した W緩衝液 (口)基質液を使用 して次 の溶液を作る。
    [0034] © 基質液 1 m£に緩衝液 3 9 ^を加え る （ 0. 4 mM ) ③ 基質液 2 に緩衝液 3 8 ^を加え る 〔 0. 8 mli )
    [0035] ⑤ 基質液 3 m£に緩衝液 3 7 m£ を加え る ( 1. 2 mM ) ④ 基質液 4 に缓衝液 3 ό ？ ^を加え る （ 1. ό mM ) ⑤ 基質液 5 に緩衝液 3 5 を加え る （ 2. 0 ) B. 測定操作
    [0036] 上記 Aの①〜⑤の容液各 2. 5 m£にそれぞれ約 1 0 0 ιυ/ζの r - GTP溶液を α 1 え、 1 分間の吸光度の 増加を 4 0 5 nm にて測定する。 そ してその各溶液に対
    [0037] G:.: I して得られた 1 分間の吸光度の増加量を Xi (Xi〜X5 ) と する。
    [0038] C. Kmの求め方
    [0039] Xi に対する Glu - 4 - NAの濃度を Si(Si〜S5) と し、 縦軸に 1 ^を、 横軸に^：を目盛 D、 上記操作で得た値 をプロ ッ ト する。 次に各フ°ロ ッ ト を直線で結び、 直線 の両端を延長させる。 こ の延長線と横軸と の交点の値 が - ^ "である。 すなわち交点の値の逆数の絶対値が Km となる。
    [0040] 実施例 3 凍結乾燥品の調製
    [0041] L - r - グル タ ミ ノレ - 4 - = ト ロ ア = リ ド 4. ό と シ ク ロ デキス ト リ ン 2. 7 9 と を蒸留水 に溶解する。 次に本溶液を、 5 ずつに分けて、 凍結乾燥を行な う。
    [0042] 得られた凍結乾燥品は、 3 の水又は緩衝液を用いて 溶解する と 1 6 mM Glu - 4 - NA溶液となる。 上記の凍 結乾燥品は、 Glu - 4 - HAのみの固形状態の も の と比較 して、 はるかに安定であ ]}、 こ の製品は、 安定状態で保 管する こ とができ る。
    [0043] 産業上の利用性
    [0044] 本発明の 7* - グ ル タ ミ ル ト ラ ン ス ぺプチダーゼの活性 測定用試薬は、 r - グ ル タ ミ ル ト ラ ン ス ぺプチダーゼ（ r
    [0045] - GTP ：) を測定する ために従来用いられて きた試蘂と比 較.した場合、
    [0046] ® 高濃度領域の基質溶液が調整可能 と なったから、 従
    [0047] 来技術 よ 著 し く正確な測定値が得られる。
    [0048] ② 基質の非酵素的分解を抑制するため、 従来技銜ょ 、 正確な測定値が得られる。
    [0049] ③ 凍結乾燥製品 とする こ とができ る ので、 従来技術よ
    [0050] 1 測定作業が著 し く 簡便にな る。
    [0051] の如き利点が得られる。 ·
    [0052] 本発明の r - GTP 活性測定用試薬は、 医学上診断に有 用に使用され、 また、 酵素化学的研究において も有用に 使用されるので、 その産業上の利用性は著 し く 大であ る。
    [0053] 一 c i一
    权利要求:
    Claims
    請 求 の 範 囲
    r - グル タ ミ ル - 4 - - ト ロ ア ニ リ ド と シク ロ デ キ ス ト リ ン と を含有する こ と を特徵とする r - ダル タ ミ ル ト ラ ンス ぺプチダーゼの活性測定用試案
    类似技术:
    公开号 | 公开日 | 专利标题
    Imoto et al.1971|A simple activity measurement of lysozyme
    Bender et al.1966|The determination of the concentration of hydrolytic enzyme solutions: α-Chymotrypsin, Trypsin, Papain, Elastase, Subtilisin, and Acetylcholinesterase1
    Schwartz et al.1971|The effect of fibrin-stabilizing factor on the subunit structure of human fibrin
    Trowbridge et al.1963|Substrate activation of trypsin
    Khalifah1971|The carbon dioxide hydration activity of carbonic anhydrase I. Stop-flow kinetic studies on the native human isoenzymes B and C
    Crowther et al.1987|Fluorometric assay of O-linked glycoproteins by reaction with 2-cyanoacetamide
    Saito et al.1968|Enzymatic methods for the determination of small quantities of isomeric chondroitin sulfates
    Beavhn et al.1971|A sensitive isotopic procedure eor the assay oe esterase activity: measurement oe human urinary kaeeikrein
    Wistrand et al.1977|Carbonic anhydrase activity of isolated brush border and basal-lateral membranes of renal tubular cells
    Hallson et al.1974|A simplified and rapid enzymatic method for determination of urinary oxalate
    Hill et al.1988|Protein determination using bicinchoninic acid in the presence of sulfhydryl reagents
    Visser et al.1972|The use of p-nitrophenyl N-tert-butyloxycarbonyl-L-alaninate as substrate for elastase
    Matsubara et al.1983|A spectrophotometric method for the determination of free fatty acid in serum using acyl-coenzyme A synthetase and acyl-coenzyme A oxidase
    Schindler et al.1977|Mechanism of lysozyme catalysis: role of ground-state strain in subsite D in hen egg-white and human lysozymes
    Hayakawa et al.1973|Subunit structure of rabbit skeletal muscle phosphorylase kinase
    Hsiu et al.1964|Alpha-amylases as calcium-metalloenzymes. II. Calcium and the catalytic activity
    US4038029A|1977-07-26|Limulus lysate turbidity test for pyrogens
    US3183173A|1965-05-11|Test composition for detecting hydrogen peroxide
    US4517287A|1985-05-14|Method and reagent for the enzymatic determination of enzyme substrates
    CA2484554C|2012-12-04|Diagnostic test for determining the concentration of transient proteolytic activity in composite biological media
    Moss et al.1975|Kinetic enzymatic method for determining serum creatinine
    DeMartino et al.1986|Autoproteolysis of the small subunit of calcium-dependent protease II activates and regulates protease activity.
    Kezdy et al.1965|Titration of active centers in thrombin solutions. Standardization of the enzyme
    Melchior Jr et al.1970|Ethoxyformylation of proteins. Reaction of ethoxyformic anhydride with. alpha.-chymotrypsin, pepsin, and pancreatic ribonuclease at pH 4
    Dorsey et al.1977|A heated biuret-Folin protein assay which gives equal absorbance with different proteins
    同族专利:
    公开号 | 公开日
    DE3152458T0||
    DE3152458A1|1982-12-02|
    JPS6440B2|1989-01-05|
    DE3152458C2|1991-02-14|
    JPS5774099A|1982-05-10|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    JPS5443791A|1977-09-13|1979-04-06|Seishin Seiyaku Kk|Method and reagent for measuring hydrogen peroxide|WO1983000876A1|1981-08-28|1983-03-17|American Hospital Supply Corp|A method for increasing the sensitivity of assays|
    US4511651A|1982-07-30|1985-04-16|American Monitor Corporation|Reagent composition and assay for the determination of γ-glutamyltransferase activity|DE2042829B2|1970-08-28|1972-11-09||Reagens zur bestimmung der gamma-glutamyltranspetidase|
    JPS51125046A|1974-11-22|1976-11-01|Ono Pharmaceut Co Ltd|Process for preparing prostaglandin analogues|
    JPH043200B2|1983-07-08|1992-01-22|||JP2590983B2|1987-12-11|1997-03-19|東ソー株式会社|難水溶性抗原の免疫測定方法|
    JPH04365706A|1991-06-13|1992-12-17|Daifuku Co Ltd|Control method for rotary rack device with shutter|
    法律状态:
    1982-05-13| AK| Designated states|Designated state(s): DE US |
    1982-12-02| RET| De translation (de og part 6b)|Ref document number: 3152458 Country of ref document: DE Date of ref document: 19821202 |
    1982-12-02| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 3152458 Country of ref document: DE |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    [返回顶部]